竹节人参中氨基酸和皂甙特征组分的分析鉴别

摘要：建立了利用液相色谱法和红外光谱法分析鉴别竹节人参中氨基酸和皂甙的特征组分的方法。分离了竹节人参中的皂甙和水溶性氨基酸，并对其中的Rb1和Rg1两种人参皂甙以及17种氨基酸进行了定性分析；粗皂甙红外图谱的主要特征峰与Rb1一致。通过与的粗皂甙的红外图谱相比较，可鉴定药品的真伪；分析样品色谱图中氨基酸和皂甙等成分的比例，可对该产品进行内在品质的鉴定。该方法简便、快速，所得实验结果代表性强，重现性良好。
关键词：液相色谱；红外光谱；特征组分；氨基酸；皂甙；竹节人参
竹节人参（Panaxjaponicus C．A．Mey．）是五加科人参属植物竹节人参的干燥根茎，含有多种人参皂甙和三七皂甙，具有滋补强壮、坠血通经、舒筋止痛、活血祛淤功能，主治跌打损伤、筋骨疼痛等，对五痨七伤均有*疗效。
国内关于与竹节人参同属的中草药人参和三七的功效成分及人参的色谱分析已有报道，但有关竹节人参的研究报道却很少。对于竹节人参主要药用成分皂甙的分析，大多只限于测定水解后的甙元，即齐墩果酸、人参二醇和人参三醇；对氨基酸的分析，一般也只用盐酸水解后测定其中的17种氨基酸，其他氨基酸（包括色氨酸）均在水解过程中被破坏，且水解条件和测定方法不同，测定结果也不同。测定以上两个项目均需水解，操作比较繁琐，费时较长，且不能全面表达竹节人参所含的主要功效成分和对其品质进行评价。近几年又发展了利用特征组分对中药材进行识别和对比的方法。
本文针对竹节人参中主要药用成分是皂甙和氨基酸这两大类物质的特点，建立了利用液相色谱和红外光谱法对竹节人参浸出物进行分离和内在品质鉴定的方法。该方法代表性强，重现性好，是一种快速、的分析方法，具有实用价值。
1 实验部分
1．1 仪器与试剂
FTIR-8300红外光谱仪（岛津）；Waters Alliance色谱系统，包括Waters 2690分离单元、2487紫外检测器和Millennium 32色谱管理系统。
对照品：人参皂甙Rbl、Rgl（中国生物制品检定所）；17种氨基酸标准品（Waters公司）。
1．2 样品制备
取竹节人参粉末1g，加水10mL，置于85℃烘箱中，保温浸提过夜，用滤纸过滤，滤液用0.45μm滤膜过滤，取10μL于50mm×6mm i．d．衍生化试管中，按6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰氨基甲酸酯法（简称AccQ．Tag TM法）测定游离氨基酸。
取竹节人参粉末1g，加水约1mL，摇匀，加入用水饱和的正丁醇溶液10mL，密塞，振摇10min，超声处理30min，放置过夜，用0.45μm针筒式过滤器过滤，残渣用正丁醇反复洗涤2～3次，滤液合并，挥干正丁醇，得粗皂甙粉末。取粗皂甙粉末2mg，用于红外分析；取粗皂甙粉末10mg，加0.5mL甲醇溶解，用于皂甙的特征组分分析。
1．3 分析条件
1．3．1 氨基酸特征组分分析的色谱条件 RPC18柱（3.9mm i．d．×150mm，填料为日本进El的5μm Fuji Silysia Cl8，自填），柱温38℃；流动相A：140mmol/L乙酸钠-17mmol／L,胺溶液（pH 5.05），流动相B：100％乙腈，流动相C：100％水，梯度洗脱；流速2.0mL／min；检测波长248nm；进样量8μL。
1．3．2 皂甙特征组分分析的色谱条件Nova-PakC18色谱柱（4μm，300mm×3.9mm i．d．，Waters公司）；流动相A：100％ H2O，流动相B：100％乙腈，梯度洗脱；流速1.0mL／min；检测波长203nm；柱温20℃ ；进样量10μL。
1．3．3 红外光谱分析条件 溴化钾压片法；扫描范围400～4000/cm；分辨率2.0；扫描次数40。
2 结果与讨论
2．1 氨基酸的特征组分分析
竹节人参的氨基酸特征组分图谱。我们对其中的17种氨基酸进行了定性。在组成蛋白质的氨基酸中，门冬氨酸（Asp）（3号峰）、精氨酸（Arg）（10号峰）、丙氨酸（Ala）（12号峰）、酪氨酸（Tyr）（17号峰）和赖氨酸（Lys）（22号峰）的含量较高；8种人体必需氨基酸有一定的含量；在酪氨酸之前未出现胱氨酸（Cys2）的吸收峰，证明不含胱氨酸；甲硫氨酸（Met）的峰很低，表明竹节人参中含硫氨基酸很少。因为对照品的限制，1，2，4，13，14，16，18和21号等8个峰还未能定性，是否为氨基酸尚不能确定，但根据AccQ．Tag TM法的特性，可知属于氨基化合物。
对产品品质的比较，可以各主要成分与参比组分峰面积或峰高的比值来确定。若以22号峰赖氨酸为标准，其余各已知组分相对于赖氨酸峰高的比例系数分别为：门冬氨酸1.74、丝氨酸（Ser）0.56、谷氨酸（Glu）0.48、组氨酸（His）0.11、甘氨酸（Gly） 0.41、精氨酸4.15、苏氨酸（Thr）0.51、丙氨酸1.16、脯氨酸（Pro）0.71、酪氨酸1.47、缬氨酸（Va1）0.74、甲硫氨酸0.24、异亮氨酸（1ie）0.52、亮氨酸（Leu）0.65、苯丙氨酸（Phe）O.60和色氨酸（Trp）0.42。该法比较全面地反映了竹节人参中所含氨基酸的情况，且提取条件与药物炮制过程十分相似，有利于研究各种成分与疗效的关系。
2．2 粗皂甙的特征组分鉴别
正丁醇提取物为皂甙粗品，要逐一弄清其成分十分困难，且对照品只有人参皂甙Rb1和Rg1，因此采用甲醇溶解Rb1和Rg1，用双波长吸收比或双柱法确定图中峰14和峰17分别为Rg1和Rb1，且Rb1和Rg1均有较高的吸收峰。Rb1和Rg1水解后分别得人参二醇和人参三醇，但实际上人参二醇和人参三醇在竹节人参水解产物中含量并不高（分别只有0.03％和0.02％，湖北测试中心测定），因此可以断定Rb1和Rg1并非竹节人参中皂甙的主要成分。
为了消除提取物纯度对指纹图谱的影响，采用其他特征峰与分离较好的Rg1的比例来确定竹节人参的品质较为适合。其他主要成分与Rg1峰高的相对比例系数分别为：3号0.24，5号0.43，12号0.48，15号0.43，16号10.69，17号（Rb1）1.36。
2．3 粗皂甙的红外图谱分析
竹节人参粗皂甙的红外图谱，在3416，2931，2876，1721，1619，1458，1259，1075，1045和553/cm等处出现了与人参皂甙Rb1相似的特征峰。红外吸收光谱表征的是化合物的基团的振动或转动能级的信息，因此一般只用作对纯度≥98％的有机物单质作定性鉴定。粗皂甙为混合物，虽然由于其中不同物质不同基团的相互作用。使得某些吸收减弱或相互抵消，红外图谱变得相对简单，但仍然可以通过与已知物质比较或根据一些特征峰获取
某些基团的信息。
在实际应用中，如果以某地的竹节人参产品的皂甙粗品的红外图谱为标准，通过与之相比较，可鉴别假冒、伪劣产品（如以续断与竹节人参同煮后冒充竹节人参等）。
2．4 方法的重现性
同一样品按以上方法在不同时间重复浸提和测量6次，其红外图谱没有差别，氨基酸和皂甙的主要特征峰保留时间的相对标准偏差（RSD）均在0.5％以内，峰高比例的RSD均在1.5％以内。
参考文献：
[1] Xu Guojun，ShiDawen．Nuture Drugs．Beijing-People’s Medical Publishing House，1989．276
徐国均，施大文．生药学．北京：人民卫生出版社，1989．276