超临界二氧化碳梯度结晶穿心莲内酯的纯化工艺研究

摘要：采用单因素试验法探讨超临界CO2梯度结晶压力、温度、时间对穿心莲内酯纯度的影响，并利用液相色谱进行纯度检测。结果表明，超临界CO2在萃取穿心莲内酯时，出现同步结晶，且在结晶板上呈梯度分布；选择较佳纯化工艺参数为压力20MPa，温度55℃，时间90min，CO2流量15L/min。时，得到穿心莲内酯的纯度达到80％以上。
关键词：超临界二氧化碳；梯度结晶；穿心莲内酯；液相色谱
穿心莲[4ndrographis paniculata（Burm．f）Nees]是爵床科，穿心莲属一年生草本植物。穿心莲主要有效成分为二萜内酯和黄酮类化合物，其中穿心莲内酯（andrographolide）类化合物临床上用于治疗急性胃肠炎、扁桃体炎、肝炎和抗癌等。穿心莲内酯的分离纯化是提高穿心莲药草附加值的重要渠道。
虽然超临界流体萃取（supercritical fluid extraction，SCFE）技术在医药、化工等领域已有几十年的历史，但就提取分离行业而言，SCFE技术还存在很大的局限性。例如，SCFE技术在提取天然药草中晶体结构的化合物时，易造成管道堵塞。为了提高超临界流体萃取分离效率和产品纯度，作者选择具有机晶体结构的穿心莲内酯为研究对象，采用超临界CO2梯度结晶以期解决部分天然药草有效成分的结晶纯化问题。本文主要研究了梯度结晶压力、温度和时问工艺参数等对穿心莲内酯分离纯化的影响。
1 材料与方法
1．1 试验设备、仪器
40MPa超临界二氧化碳萃取结晶装置，1.6L梯度结晶釜（高径比l0：1），电子天平（ 海分析仪器厂），Waters HPLC系统，包括5l5型输液泵、2487紫外双光束检测器、Rheodyne7725i型手动进样器和Millennium32化学工作站。
1．2 材料
穿心莲浸膏（穿莲内酯含量为30％）由合肥拓峰生物工程有限责任公司生产，穿心莲内酯标准品购于中国生物制品检定所，二氧化碳（99.8％ 食品级）。
1．3 方法
试验分3步进行。*步，原材料前处理，即先用乙醇在温水浴条件下溶解原材料，再沉淀、过滤；第二步，用超临界二氧化碳萃取结晶滤液；第三步，取样检测、分析。
1．4 含量测定
1．4．1 标准曲线的制备 称取穿心莲内酯对照品1.82mg，置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。吸取该溶液1.0ml，转移至5ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀。进样针吸取稀释液，依次进样2、6、10、14和l8u1；液相色谱检测条件．Waters Symmetryshield 5μm C18柱（3.9mm×150mm）色谱柱，甲醇-水（65％-35％）为流动相，流速1.00ml/min。检测波长205nm，以色谱峰的面积为纵坐标，进样量（μg）为横坐标进行线性回归。穿心莲内酯在0.14～l.3lμg范围内与峰面积呈线性关系，回归方程为：Y=3472+673X, r=0.9976。
1．4．2 结晶产物中穿心莲内酯的测定 称取结晶产物2.00mg，置25ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得样品溶液，再参照文献进行检测、分析。
2 结果与分析
2．1 压力对萃取结晶穿心莲内酯的影响
2．1．1 结晶板不同部位压力与纯度的变化关系 为了研究超临界二氧化碳萃取结晶穿心莲内酯晶体分布情况，试验原料采用30％穿心莲内酯浸膏。在控制萃取结晶釜温度55℃，萃取时间为90min，CO2流量为l5 L/min。条件下，选择压力为l5MPa。将结晶板白底至顶部平均分为5段，由下至 取样，压力一纯度变化曲线。
2．1．2 结晶板同一部位压力与纯度的变化关系 选择压力为8、l2、l6、20和24MPa时，将结晶板自底至项部平均分为3段，在上部和下部取样。
2．1．3 结晶板同一部位压力与结晶量的变化关系选择压力为10、15、20、25和30MPa时，将结晶板平均分为2段，由上部取样，得压力．结晶量关系。
变化规律说明，穿心莲内酯的纯度在结晶板上呈梯度分布，可能是穿心莲内酯与其它杂质在超临界CO2中因流体挠动、重力、分子间作用力及结晶板表面吸附力作用差异，优势结晶效用形成梯度结晶分布；由图、表可知，在其它工艺参数不变的情况下，随着压力的升高，结晶板上部纯度越来越高，上部的结晶量先增后降。因压力升高，SC-CO2溶解能力增强，携带晶体析出量增加，出现纯度及结晶量的增加；而压力超过一定值，超临界流体的*溶解能力必将削弱结晶，而萃取到分离釜的穿心莲内酯量增加，所以选择较适宜的压力值20MPa，产品纯度达到80％以上，相对结晶量达38.7％。
2．2 温度对萃取结晶穿心莲内酯影响
萃取-结晶压力为20MPa，萃取时间90min，CO2流量15L/min，原料采用纯度30％穿心莲内酯浸膏。试验温度分别为35、45、55和65℃。结晶板自底至顶部平均分为3部分，在上部和下部取样，得温度．纯度变化曲线，记录结晶温度与时间数据，得温度．时间变化曲线。可知，适当升高温度有利于穿心莲内酯结晶，更有利于提高时效；温度超过55℃后，穿心莲内酯晶体纯度下降，可能是温度升高，分子活性增强，当超过结晶板表面吸附力、重力、分子间作用力等的束缚温度，萃取分离占优势，而结晶析出转为
劣势。所以，选择较佳结晶温度为55℃。
2．3 时间对萃取结晶穿心莲内酯影响
在萃取结晶压力为20MPa，萃取结晶温度55℃ ，CO2流量15L/min条件下，试验萃取结晶时问分别为45、60、75、90、105和120 min时，将结晶板平分为2段，由上段取样，得时间、纯度变化曲线。
可知，在其它工艺参数不变的情况下，内酯纯度与温度呈正相关，特别是当时间超过75min后，纯度变化缓慢，考虑到晶体纯度与结晶量的不同步性，结晶量的积累还需要后延，所以本试验选择的萃取结晶时间为90min，纯度达80.0％以上。
2．4 试验工艺流程及结果
取50g原料，按照固液比1：3溶解（液体为分析级乙醇），50℃水浴搅匀，静置、分层、过滤，再进行萃取结晶：设定萃取结晶压力20MPa，温度55℃，选择时间为90min，CO2流量15 L/min。试验结束后，取出结晶器，分段称量、检测。可知，获得纯度高达82.3％的穿心莲内酯。
3 结论
超临界CO2在萃取穿心莲内酯的同时，出现了同步结晶，且晶体在结晶板上按纯度呈梯度分布；随着梯度结晶压力的升高，结晶板上部穿心莲内酯纯度逐渐升高，且变化趋势由急变缓，而结晶相对量先增后减；随着梯度结晶温度的升高，穿心莲内酯的纯度先升后降；时间与穿心莲内酯纯度呈正相关系。在本试验条件下，较佳工艺参数为萃取结晶压力20MPa，温度55℃，时间90min，CO2流量为15L/min时，多次试验结果均可获得穿心莲内酯高达到82.3％。
References
[1] Du Q Z，Jcrz G，Winterhalter P．Separation of andrographolide and neoandrographolide from the leaves of Andrographis paniculata using high—speed counter-current chromatography．Journal of
Chromatography A，2003，984：l47一l5l