前言
日前的央视要闻报道中，乐纯生物LePhinix®️ 一次性生物反应器作为上海重要科技创新成果出镜。事实证明，从上游工艺、耗材环节创新突破，是赋能甚至反推中国生物制药产业链全链条“做大做强”的必要条件。本次引发高层领导和媒体关注的一次性生物反应器，是乐纯生物于2022年推出的自研产品。一次性生物反应器是典型的卡脖子产品。从所应用到的生物工艺film薄膜到数字化控制系统，全部都有其技术难点。乐纯生物LePhinix®️ 一次性生物反应器背后有扎实强大的研发支撑，在不断推出新产品的同时，也形成了丰富的理论成果，定期在行业内开源分享。
借本次机会，将该项目应用技术负责人孙焕博士一篇技术干货文分享给大家，看乐纯生物如何攻克2000L一次生物反应器的放大要点及难点。
纯技术干货，建议深阅读——
生物工艺在逐级放大过程中，为保证细胞在相对恒定的环境中可实现稳定的增殖和表达，通常在不同的规模下会采用相对变化的培养方式，在生物反应器中实现最终的线性放大。
在前期进行细胞株开发时，多采用简单的摇管或摇瓶筛选单克隆和培养基，并进行简单的工艺策略摸索。
为能更好的摸索关键的工艺控制参数，如pH、DO、pCO2水平、连续补料的方式和速率等，后期的工艺开发越来越多采用智能化小型生物反应器来进行工艺控制，以达到更好的培养效果，并方便依据锁定工艺后的控制条件进行后期的工艺放大。
研发阶段使用的罐体一般多种多样，罐体的高径比、桨叶形状、桨叶直径、搅拌形式、通气方式和通气孔径，与放大后使用的罐体很难达到完全一致。考虑到操作便利性和厂房高度等因素，多数供应商不同体积罐体并不能实现等比例尺寸的放大，这就为后面的放大造成了一定的挑战。
一般来说，放大主要从两个维度来综合考量，一方面是体积相关工艺参数的放大，如搅拌速度、通气量等相关工艺条件，需要综合反应器的高径比、桨叶直径、P/V、混合时间、KLa等进行搅拌速率的换算，并通过表观通气速率和单位体积气体流速拟定通气量；另外一方面是非体积相关工艺参数的放大，包括补料速率、pCO2水平控制、通气方式、通气孔径的选择等，需要结合pH和DO的控制和细胞的耐剪切力水平，采用经验放大的方式来进行。
乐纯生物LePhinix®️ 2000L一次性生物反应器CFD图
a. LePhinix® 2000L 速度矢量图(70rpm )
b. LePhinix® 2000L 湍流强度图(70rpm)
c&d. LePhinix® 2000L 剪切强度分布图
对于终端应用客户而言，细胞培养过程中的工艺放大多从以下几个方面来考量：
恒定体积功率P/V
使用恒定的单位体积功率输入(P/V)是哺乳动物细胞放大培养中常用的放大方法之一。反应器的功率输入(P)与桨叶的直径(Di)和搅拌的转速(N)成正向关系，桨叶的直径越大，转速越高，反应器的功率输入就越大。
不同的反应器，相同桨叶直径和转速的情况下，由于桨叶形状、角度、位置和尺寸大小的不同以及罐体的差异，功率常数(Np)不同，功率输入也会有所变化。
单位体积的功率输入：P/V=NpN3Di5ρ/V
其中：
• P —— 桨叶的功率输入
• V —— 液体体积
• Np—— 功率常数
• N —— 桨叶转速
• Di —— 桨叶直径
• ρ —— 液体密度
在从小罐逐级放大到大规模体积培养的过程中，我们多遵循P/V值相对恒定的方式进行放大，在等P/V值的情况下，根据不同规模罐体桨叶直径的变化，换算出转速的差异。在对CHO细胞进行放大培养中，我们常用的P/V范围一般会在10~30W/m3。同时，实际的操作过程中，也多参考供应商或者历史数据的转速范围进行转速的微调。
恒定体积气体流速vvm
在细胞放大培养的过程中，第二个重点关注的放大点，即是气体流速。
一般来说，一次性生物反应器会给予一个恒定的底部通气和一个恒定的表层通气，起始通气速率一般为0.005vvm-0.01vvm，即50L体积的通气量为0.25L-0.5L，200L的通气量为1L-2L，2000L的通气量为10L-20L。根据工艺的不同，一般空气多通过大泡进行恒定速率的通气，氧气的通气量根据细胞的氧气消耗速率通过DO进行调控；当消耗量比较大时，可采用微泡通气的方式提高气液传质效率。
氧气传质系数KLa
KLa的评估多在选择反应器之初进行，这对于中试和商业化规模应用至关重要。KLa反应的是气体的传质速率，是反应器的桨叶设计、通气孔径大小、混合时间和气体混合效率等的一个综合评估指标，评估的是反应器的整体设计性能。
对于实验室规模的生物反应器，由于体积比较有限，通常更容易达到必要的氧传输速率。通常，根据实验室规模系统中的培养结果，按照同等气体传质效率的原则，参照选择中试和商业规模的生物反应器。
混合时间
混合时间在实际的放大过程中多做为参考。实验室规模的小体积反应器混合时间非常短，随着规模变大，需要更高的搅拌速率来达到同样的混合时间，或者在最大限速下无法达到小体积的混合时间。而且，更高的搅拌速率，会带来更高的剪切应力，特别对于高敏感细胞株，会带来不可逆的细胞损伤。因此，规模变放大过程中会关注混合时间，但是并不会做为主要的放大依据。
CO2去除
规模放大的过程中，常遇到的一个问题是CO2的蓄积，且规模越大，蓄积效应越加明显。高浓度的CO2 往往会抑制细胞的生长代谢，甚至造成细胞毒性效应，因此规模放大过程中常采用加大底部通气量的方式来驱除CO2，并且采用高效的大泡通气的方式。在较大规模，如采用1000L以上规模培养时，常规的提高底部通气的方式进一步受到限制，因此设计上会采用单独一路更大孔径通气孔进行通气，以达到有效消除CO2蓄积的目的。
乐纯生物细胞培养线性放大的王牌组合
乐纯生物开发的LePhinix®️一次性生物反应器涵盖了50L至2000L，便利的上开门设计，左右两侧人性化的管路梳理装置，顶部加入底部通气滤器夹子，底部搭配水夹套设计，有效的满足工艺应用的需求。适配的LeKrius®️一次性生物反应袋，顶部补料管路可根据反应器高度适度加长方便焊接，底部通气管路加入防液体倒流装置有效降低操作失误。
左：LePhinix®️ 一次性生物反应器全系列
右：LeKrius®️一次性生物反应袋
同时，乐纯生物强大的售前和售后支持团队，可根据客户要求进行一次性反应袋的定制化设计和配置。
LePhinix®️ 一次性生物反应器规格
放大过程中的关键工艺控制点
生物反应器放大过程中，除了最为关键的搅拌转速和通气速率等因素外，还应通盘考虑整个工艺过程中的多重控制点，如培养基的过滤和收获后的深层过滤，不同体积下补料的添加速率，体积变化导致的CO2控制策略变化，放大中的工艺参数偏移带来的关键工艺指征有所转变等等。滤器一般都可以直接通过线性放大的方式进行简单放大，只是规模进一步放大过程中，操作时间的控制也需要综合考虑进去。如溶液配制过程中，为了控制生物负载，需要控制配液的总时长。如细胞收获步骤，为了提高收获效率和保证蛋白质量，需要反应器进行降温操作，并通过高通量和高流速实现控制收获的总时间。
大体积培养基的配制过程，往往会出现小体积配制过程中意想不到的问题，如pCO2的控制失误可能导致pH出现偏差，大量粉末的大批量加入带来的粉尘问题，搅拌速度限制导致的粉末不能及时有效混合等等，因此在大体积的配制过程中选用的设施设备包括耗材等应充分考虑这这些因素，如增加搅拌时间，使用投料袋、控制溶液的配制时长等等。另外，大体积的溶液储存方式也会发生变化，加上配制时间的增长，这要求我们需要综合考虑溶液的配制时间和储存时间，进行合理的规划。
除此之外，通气的增加带来的大体积培养过程中有效通气速率和气体储量也是我们需要进行考量的；放大过程中的控制水平偏移可能导致的工艺触发条件发生变化，如触发降温的时间将会发生变化，这就需要工艺转移过程中除了关注降温的时间，还应该加入细胞密度这个最为关键的因素，以达到更加合理化控制的目的。
下周为大家具体解析乐纯生物2000L 细胞培养放大的最新案例，敬请期待！
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