b-环糊精构筑模拟苹果酸脱氢酶的研究

开发具有与酶功能相似的人工酶已成为化学领域的热门课题之一。可以作为脱辅基酶蛋白代用品的分子虽有若干种，迄今被广泛采用且较为*的是环糊精体系。环糊精构筑的作为氧化还原酶的酶模型不如水解酶多,它们的作用各不相同，有的是模拟NADH 还原茚三酮[1]，有的能可逆结合分子氧，并有较长的半衰期[2,3]，有的作为铁氧化还原蛋白酶模型[4,5]，但作为模拟苹果酸脱氢酶的酶模型未见报道。 本文是以间羧基苯磺酰氯修饰b-CD的产物，与三氯化铁反应，制得双（6-氧-间羧基苯磺酰基）-b-CD.Fe3+ 配合物构筑模拟L-苹果酸脱氢酶，将L-苹果酸催化氧化生成草酰乙酸。模拟了苹果酸在生物体内三羧酸循环中zui后一步氧化还原反应,借助氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）作为氢的受体，反应中生成的还原型辅酶Ⅰ（NADH）量与L-苹果酸量间呈一定化学计量关系， 可通过在 340nm 处测定NADH的吸光值变化求出苹果酸的消耗量或草酰乙酸的生成量。
在标准热力学条件下，反应平衡有利于逆反应，因生理情况下，反应产物草酰乙酸不断合成柠檬酸而移去，使其在细胞中的浓度降低，反应向正反应进行[6]。笔者在模拟酶的催化反应中加入截获剂（2,4-*肼），在pH 9.00的甘氨酸-NaOH缓冲溶液中使草酰乙酸转变为草酰乙酸腙，促使反应也向正反应进行[7]。
    其反应式如下： 
    
    
    
    
    
1 实验
1.1 仪器与试剂
    岛津AA-646原子吸收光谱仪，AIC UV-9100型紫外-可见分光光度计（深圳爱克分析仪器有限公司），pHS-3C数字酸度计（杭州万达仪器仪表厂），β-CD为苏州味精厂工业品经两次重结晶，L-苹果酸、L-苹果酸脱氢酶，生化试剂（SIGMA CHEMICAL CO.），NAD，生化试剂（上海伯奥生物科技公司），2,4-*肼，分析纯（上海化学试剂总厂）。其余试剂均为分析纯。
1.2 模拟酶的合成
    配制0.11mol.L-1b-CD-（M）2（合成和结构鉴定结果：核磁共振光谱及元素分析数据参看文献[8]）水溶液30mL，0.48 mol.L-1 FeCl3水溶液40mL，将FeCl3溶液全部加入搅拌下的b-CD-（M）2溶液中，此时，溶液由无色逐渐变为黄色，zui后得一橙红色透明溶液。将此溶液置恒温水浴锅中，于70°C恒温8h冷却，过滤。向滤液中加入适量丙酮，析出淡黄色絮状沉淀。静置过滤，用95%乙醇洗涤至滤液中无Cl-止，抽干后置于干燥器中，得干燥淡黄色粉状固体即:b-CD-（M）2.Fe3+重4.6g，产率88%。经薄层层析紫外检测所呈斑点的Rf=0.66（展开剂：乙酸乙酯:甲醇:冰醋酸:水＝12:3:3:2），红外gmax：3300cm-1（s,OH），2900cm-1（w，CH2），1720cm-1（w,C=O），1625，750cm-1（mw,苯环），1143cm-1（w，ArSO2），原子吸收光度法测出Fe3+的量，证明配合物中b-CD-（M）2与Fe3+的摩尔比为1∶1，M?ssbauer谱证明是Fe3+状态。
1.3 模拟酶的催化反应
1.3.1催化反应 在比色皿中分别加入pH 9.00的甘氨酸（Glycine）-NaOH缓冲液（含2,4-*肼）3mL，1mol.L-1的NAD+ 50mL，4.44mmol.L-1模拟酶30mL，1mol.L-1的苹果酸30mL，混匀，反应温度25°C，以30mL缓冲液代替底物L-苹果酸的溶液作对应参比，在NADHzui大吸收340nm处测A340值。对比实验：用FeCl3代替模拟酶，其它条件与前述相同。
1.3.2底物浓度对模拟酶催化反应速率的影响──用双倒数作图法求模拟酶的米氏常数 在比色皿中，分别加入pH 9.00的甘氨酸-NaOH缓冲液2.7 mL，1mol.L-1的NAD+ 200mL，0.523mol.L-1的2,4-*肼30mL，4.44mmol.L-1的模拟酶30mL和不同量的底物（苹果酸）作为测量池,在反应温度25°C条件下，同样用不加底物的溶液作对应参比（均用缓冲液定容至3.10mL）,测A340值,并求得催化速率，即：V＝DC/Dt＝DA/ε.Dt,式中:e为NADH的摩尔吸光系数,在340nm处为6.3×10-6 L/mmol.cm-1[9]，底物浓度[S]已知，由1/V对1/[S]作图求得模拟酶的米氏常数Km。
1.4 条件实验
1.4.1 pH值对模拟酶反应速度的影响 在比色皿中,分别加入pH值为8.79,9.00,9.50,10.00和10.70的甘氨酸-NaOH缓冲液2.7mL，1mol.L-1的NAD+ 50mL，0.523 mol.L-1的2,4-*肼30μL，4.44 mmol.L-1的模拟酶30mL，1mol.L-1 L-苹果酸30mL，混匀后以对应空白（即以相应pH值的缓冲液代替底物）为参比，测其A340的变化。
1.4.2 模拟酶浓度对模拟酶反应速度的影响 在比色皿中加入2.7mL pH9.00的甘氨酸-NaOH缓冲液，1mol.L-1 的NAD+ 50mL，0.523 mol.L-1的2,4-*肼30mL，1 mol.L-1 L-苹果酸20mL，4.44mmol.L-1的模拟酶分别取10,15,30,40,50,60,70mL,用缓冲液定容总体积为2.90mL，混匀后以对应空白（即以pH=9.00的缓冲液代替底物）为参比,测其A340的变化。
1.4.3 2,4-*肼浓度对模拟酶催化速度的影响 在比色皿中加入2.7mLpH=9.00的甘氨酸-NaOH缓冲液，1 mol.L-1 的NAD+ 50mL，4.44mmol.L-1的模拟酶30mL,1mol.L-1 L-苹果酸30mL，0.523mol.L-1的2,4-*肼分别取10,15,20,25,30,40,50,60,70mL，用缓冲液定容总体积为2.90mL，混匀后以对应空白（以pH=9.00的缓冲液代替底物）为参比，测其A340的变化。
1.5 对照实验
    用1/100浓度的 SIGMA 公司经透析后L-苹果酸脱氢酶原酶液30mL代替模拟酶，同在25°C条件下，并确保其他实验条件相同，测定生物酶在此体系中的米氏常数Km值。
2 结果与讨论
2.1 催化速率    
图1 模拟酶催化苹果酸的动力学曲线
a 模拟酶（▲） b FeCl3（■）

    图1结果可见模拟酶的催化速度比FeCl3快得多，而曲线a表明了模拟酶将L-苹果酸催化氧化生成草酰乙酸的催化动力学过程，且催化反应在6 min前速度很快，基本呈线性，6 min以后反应速度增加缓慢, zui后趋于不变，表明反应已进行*。故计算催化速率时Dt选择5min以内。为了便于在测定米氏常数中与生物酶对照，我们在生物酶的测定*酸度pH=9.00处测定，若在模拟酶的*酸度pH=9.50处测定，催化速率更快。
2.2 反应条件
    在条件实验中，从图2可知pH值对体系的催化反应有一zui适宜酸度，即pH 9.5，大于或小于此值， 体系的催化能力均有不同程度的下降，而生物酶的zui适pH值为9.00，这也说明模拟酶在这方面与生物酶较为接近。图3曲线a表明，当底物L-苹果酸的浓度一定时, 模拟酶的浓度与反应速度成正比；曲线b表明在此反应体系中，2,4- *肼的加入量有一*值（4.46mmol.L-1）。
       
图2 酸度对反应速度的影响图3 模拟酶和肼的浓度对反应速度的影响
a 模拟酶（C×10-5mol.L-1）（▲）
b 肼（C×10-3mol.L-1）（■）

2.3 模拟酶与生物酶在相同催化条件下的Km值
    根据双倒数作图法[10]，米氏方程可写为以下形式：V-1＝Km.Vmax-1.[S]-1 + Vmax-1。
    笔者通过实验，选择不同的[S]测定相对应的V，求出两者的倒数，以1/V对1/[S]作图，给出直线（见图4），其直线方程分别为：Va-1=0.0307[S]-1+3.5142（模拟酶）和Vb-1=0.0325[S]-1+4.2738（生物酶），因此，可求得生物酶的米氏常数（km）生物酶＝0.0325/4.2738＝7.60mmol.L-1，模拟酶的米氏常数（km）模拟酶＝0.0307/3.5142＝8.74mmol.L-1。km的值愈小，表明酶对底物亲和力愈大[11]，显然此时不需要很高的底物浓度就可以很容易地达到酶促反应的zui大速度Vmax。根据所求得米氏常数进行比较，可知：（Km）模拟酶∶（Km）生物酶＝1.15∶1，这表明模拟酶对底物的亲和力比生物酶稍弱些，但很接近。
   
图4 Lineweaxer-Burk双倒数作图法
a 模拟酶（▲）
b 生物酶（苹果酸脱氢酶）（■） 

    酶活力的大小可用一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即酶催化的反应速度愈快，酶的活力就愈高。从图2可看出，1.332×10-4mmol模拟酶在25°C，pH=9.00的条件下对酶促反应速度zui高可达2.34 mol/L.min,而用1/100纯生物酶原酶液30mL在相同条件下，在此体系中对酶促反应的zui大反应速率达0.287 mol/L.min，显然，用1.332×10-4mmol模拟酶催化此反应，zui大反应速率比1/100生物酶原酶液30mL催化此反应的zui大反应速率高8倍。
2.4 小结
    综上所述，b-CD-（M）2.Fe3+ 成功地模拟了生物体内三羧酸循环中zui后一步氧化还原反应。模拟了L-苹果酸脱氢酶，在常温下，迅速使L-苹果酸脱氢，生成草酰乙酸，其它无机催化剂却不行（如FeCl3），可达到生物酶在此体系同一数量级的催化效能， 生物酶的米氏常数为7.60 mmol.L-1，模拟酶的米氏常数为8.74 mmol.L-1。且在反应产物中加入一定量的丙酮等有机溶剂，模拟酶会析出，借此将模拟酶与产物分离， 回收的模拟酶与FeCl3反应再生后，用于催化氧化苹果酸，其催化效能无明显影响。
    模拟酶制备容易，使用方便，价格便宜，无毒无害，既克服了生物酶受环境影响较大的缺陷，又可回收再生，循环使用。可以说这是一种大有发展前途的人工合成仿生化合物。
3 参考文献
[1] Yoon C J,Ikeda H, Kojin R et al. J.Chem.Soc.Chem Commun.,1986, 1080.
[2] Kuroda Y,Hiroshige T,Sera T et al. J. Am.Chem.Soc.,1989,111:1918.
[3] Kuroda Y,Hiroshige T,Sera T et al. Carbohydr.Res., 1989,192:347.
[4] Siegel B. J.Inorg.Nucl.Chem., 1979,41:609.
[5] Kuroda Y,Sasaki Y,Shiroiwa Y et al. J.Am.Chem.Soc., 1988,110:4049.
[6] 沈同, 王镜岩. 生物化学（下册）. 北京:高等教育出版社,1995:99.
[7] Townshend A,Vaughan A. Talanta ,1970,17:299.
[8] 丁志刚.刘学群等.化学学报,1995, 53:578-582.
[9] 李疏琦.现代酶法分析.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社出版,1994:93.
[10] Lineweaver H,burk D.J. J.Am.Chem.Soc., 1934,6:658.
[11] 沈同,王镜岩.生物化学（上册）. 北京:高等教育出版社, 1995:251