DNA的转化

体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒,选用转化和筛选技术,可获得含重组的阳性克隆.

实验原理：
    体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒,选用转化和筛选技术,可获得含重组的阳性克隆.在此阳性克隆中, DNA 可在生物体系中大量扩增,繁殖,保存以及表达目的基因的产物,这是PCR体外扩增DNA所不能替代的.配合DNA重组技术,所获得的,不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研,医药生产和生物发酵等领域.
    质粒 转化不同 细菌 有不同的转化效率,转化效率的高低与实验的成败直接相关, 通常转化效率可达105－107转化子/μg DNA.获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备.感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态,只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子. pUC18的LacZ基因区域当有DNA片段插入时,LacZ基因失活,转化进入 大肠杆菌 并在含有IPTG和X-gal培养基生长时,会产生白色的克隆,不含插入片段的pUC18质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落.
DNA分子转化分以下几步：
1、 吸附-- 双链DNA 分子吸附于受体菌表面；
2、 转入--双链DNA分子解链.一条链进入受体菌,另一条降解；
3、 自稳--外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；
4、 表达一供体基因随同复制子同时复制,分裂, 转录翻译.

实验试剂：
LB培养基
      质粒DNA（含Amp抗生基因）,受体菌
      CaCl2 0.1M
      Amp

实验过程：
1、 感受态细胞 制备及CaCl2处理：
1) 将宿主菌在琼脂培养基平板上划线,37℃培养16～20小时.
2) 挑取单菌落转入20mL LB培养基锥瓶中,37℃振荡过夜.
3) 从中取2mL菌液转入50mL LB培养基中37℃振荡培养4－5小时,测OD100达0.4～0.5.
4) 培养物于冰上10分钟.
5) 转入－50mL 离心管 ,于4000rpm下4℃离心10分钟.
6) 弃上清,倒置离心管1分钟,流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2,置冰上10分钟.
7) 4,000rpm 4℃离心10分钟,弃上清.
8) 加入2ml,0.1M CaCl2悬浮细胞,于4℃过夜.