美国    干细胞胎牛血清

一、 牛血清在细胞培养基中的主要功能
牛血清是细胞培养中用量zui大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。

1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。

3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

5.起酸碱度缓冲液作用。

6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

二、 牛血清的主要成份
血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常
随供血动物的性别、年龄、生li条件和营养条件不同而异。

1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。
纤维粘连素 细胞促进细胞附着；
α2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白 促细胞附着；转铁蛋白 能结合铁离子，减少其毒性
和被细胞利用。

2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分lie，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞
生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。

3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。
胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分lie有关。
类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。
促生长激素：促细胞增殖效应。
qing化ke的song：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的qing化ke的song
，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。

4其他成份
氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意
义。

三、 牛血清的质量要求
随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到
的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也
不断提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。

（一）、WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：

1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。

2.有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。

3.证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。

5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。

6.对细胞有良好的支持繁殖作用。

（二）、我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质kong标准》中提出比较严格的标准要求。包
括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。

（三）、美国对牛血清的质量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美国牛血清供应商的牛血清都已进入到我国市场，
他们对其质量标准要求都极为严格，从血清来源到产品质量都有明确规定。

1） 血清来源：可从世界各国收集胎牛血清，但是必须符合他的质量标准和美国*进口要求。地方当局还不
清楚本地是否有牛海绵状病毒流行的血清不收集，有说明血清质量的证明资料：包括收集过程的全部资料、检验
结果和交付情况。

2）血清的收集：胎牛血清是心脏穿刺取血，新生牛（10～14天）和小牛（10个月内）血清静脉取血。血清采集条
件必须符合工业生产的标准：低温下采集、一次分离、分离后立即混合冻存。符合要求的血清56℃水浴30分钟灭
活。

3）血清的制备：
a. 超低IgG胎牛血清：通过亲和层析工艺去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量减到zui低，一般IgG≤5ug/ml，生物学活性不变。

b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧
化酶／过氧化酶方法测定）。

c. γ－射线照射：已经证明γ－射线照射可以有效灭活血清中可能污染的病毒、支原体。照射剂量为30～45KG。
而且这个剂量的γ－射线照射不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响。

4）除菌过滤:经过上述处理的粗制血清再经过一系列除菌滤膜过滤包括0.2微米（micron）和0.1微米滤膜。FBS要
通过三层0.1微米滤膜，其他血清可通过0.2微米滤膜。

4.终产品血清质量

1）化学检定：渗透压
pH
蛋白含量――电泳法
白蛋白 球蛋白 血红蛋白
随着牛年龄增加血清中总蛋白含量相应增加，总的血清蛋白含量可以确定产品规格和年龄。
2） 微生物学检查：细菌、真菌符合USP标准。
支原体：在支原体专业培养基上培养了3～4周，培养温度36℃±2℃
分别在需氧和厌氧条件下进行，有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4次，Hoechst荧光素DNA染色检查那些培养法
无法检出的支原体如猪鼻支原体等。

病毒检查：
牛兰舌病毒 Bovin blue tongue
牛腺病毒 Bovine Adenovirus
牛细小病毒 Bovine Parvovirus
牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus
狂犬病病毒 Rabies
呼肠弧病毒 Reovirus
牛呼吸道合胞病毒 BRSV
副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza

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检查方法：
已证明无外源因子污染的牛细胞培养物，在细胞生长液中加15％待测血清，连传3代共21天。阴性对照细胞培养液
中加15％已知无病毒污染的牛血清，与试验组同条件下进行。在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变。在观察
期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查。

如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内。阴性对照样品按同样方法。再将牛腹泄病毒、牛细
小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照，再培养7天，用荧光
抗体技术进行检查。

细胞病变或病毒引起的其他改变通过苏木精或伊红染色进行观察。取另外一个待检细胞培养瓶用人“O”红细胞、
豚鼠红细胞和新鲜鸡红细胞作血球吸附病毒检查。试验在2～8℃和20～24℃进行。阴性对照细胞预先感染副流感
Ⅲ型病毒作为阳性对照。未感染的细胞作为阴性对照。

3）内毒素检测
用鲎试剂检查。

4）细菌噬菌体检查
主要检查E.Coli(C300 or K-12)噬菌体。

5）激素含量测定
每批FBS对某些激素含量都要进行测定，包括：雌二醇、胰岛素、孕硐、睾wan素、甲状腺素等。

6）血红蛋白检测
血红蛋白与氧合血红蛋白的比≥70％，血红蛋白含量≤mg15/dl。

7）细胞生长效果测定
a.细胞克隆效果测定
细胞选择：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653
血清浓度与细胞数:
10％血清／1个细胞／孔
4％血清／5个细胞／孔
细胞培养基RPMI－1640， 96孔培养盘36℃±2℃，5％二氧化碳培养10～
15天。试验中选择一个已知参考牛血清作对照。
克隆效率计算：
克隆效率＝(阳性孔平均数/ 培养孔总数) X100％ 

相对克隆效率＝待测血清克隆效率/参考血清克隆效率

b.贴壁效率试验：
用人的传代细胞作每批血清的贴壁效率试验，A549（人肺癌细胞）该细胞可以反应出低浓度血清的贴壁变化。采
用6孔培养盘每批血清用两种浓度和两种不同的细胞接种数即10％血清――100细胞／孔，4％血清200介细胞／孔
。放36℃±2℃，湿润5％二氧化碳培养箱培养10～14天，计算着色细胞克隆，确定贴壁效率。从这两种不同血清
浓度来确立实验血清支持细胞贴壁生长的水平，分析两种试验条件下平均贴壁效率。

贴壁效率（％）＝(每孔克隆平均数/ 每孔活存的培养细胞平均数) X100％

相对贴壁效率＝被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率
c. 二倍体纤维细胞促生长试验
人二倍体细胞株 WI28 MRc5

25cm2细胞培养瓶，5％血清，每瓶接种1.5X105细胞连传3代，每代血清浓度和接种细胞数相同，每代培养7天，每
代接种二个细胞瓶，36℃±2℃培养。以同样条件用已知参考血清进行平行培养。每代收获细胞计数，计算每批待
检血清与参考血清的相对生长率（RGR）。

RGR＝(试验血清每瓶细胞平均数/ 参考血清每瓶细胞平均数) X100％

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ELISA试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。2SD是一般*的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过2SD应作为"告警"，二次超出2SD为"失控"。当质控过程中，出现失控时，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原 因时，应重复进行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。一般认为：①一次超出3SD。②连续二次超出2SD。③3-5次连续处于一侧的2SD之内。 ④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。5.2.1 质控血清的使用 卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在-20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。

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*类，zuiGAO级别，是专门用于干细胞 的特级胎牛血清
1、Hyclone的特级胎牛血清
目前，性能的血清，还是要说说Hyclone的特级胎牛血清，货号是SH30070.03，它是Hyclone的“招牌菜”。
Hyclone特级胎牛血清(Defined FBS)，货号SH30070，是世界上唯yi经过40纳米过滤的顶ji胎牛血清，的促细胞生长作用及产品稳定性。内毒素含量≤10EU/ml，血红蛋白含量≤10mg/dl。
此血清可以广泛用于各种细胞培养 ，包含任何干细胞系的培养。
因为美国那边有疯牛病，无法进口。实际上，40nm的过滤，已经将全部的病毒、支原体处理掉，同时，是用于科研级别的，洁净程度非常高。不让进口，只是我们国家为了保护本国畜牧业的一个手段，针对牛肉方面，而胎牛血清是受到殃及而已。
2、Gibco的特级胎牛血清
稍次一点的是Gibco公司在美国原装生产的特级胎牛血清，这款血清，货号是16000-044，是100nm过滤3次，内毒素和血红蛋白含量都可以与Hyclone的SH30070.03相媲美。也可以用于培养大部分的干细胞 系。同样是美国来源，所以渠道特殊。
3.TCB的特级胎牛血清
TCB(Tissue Culture Biologicals)公司作为一家生物行业类的供应商，成立于1978年，大部分血清的采集和加工都在加利福尼亚。每一批的原材料都经过严格筛选，所有的产品都在FDA认证的cGMP车间进行!
TCB 公司一贯重视产品质量，为客户提供zui的血清及相关产品，经过多年的发展，公司产品种类丰富，各种品质的血清和培养基能满足所有实验室的需求。
TCB 公司经过美国食品*(FDA)和美国*(USDA)的*认证。与人相关的产品符合疾控中心(CDC)的相关法规。
TCB是美国*(USDA)动植物 *(APHIS)兽医处(VS)下属的国家动物进出口中心(NCIE)的检疫认可单位，允许可控原材料、组织、细胞等的进出口贸易!
4. Bioind特优级胎牛血清
血源来自北美和澳大利亚BioInd公司的生产*符合GMP的要求，并通过ISO9000:2001和ISO 13485:2003质量认证。
以安全，稳定，为原则的BioInd公司，所有的产品质量均*符合标准。Biological Industries主营细胞培养 类产品，BioInd工厂加工的胎牛血清均符合USDA标准及欧洲标准血清。根据美国*标准，原始血清均采自未发生疯牛病(BSE)和口蹄疫(FMD)疫情的国家。Biological Industries三步滤菌处理法，zui后的过滤步骤为连续通过三个100纳米的滤膜。血清生产的洁净级别为100级。所有分装工作台都通过微粒空气过滤器过滤，并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微粒数和压力进行监控。分装之后，终产品迅速-20度冻存，并隔离，直到所有的质量控制检测完成.
第二类，优等胎牛血清
给您推荐几款，如下：
1、Hyclone的加拿大优等胎牛血清
的是Hyclone加拿大优等胎牛血清(CharacterizendFBS)SH30396.03 血清采自加拿大，由hyclone公司总部的员工采集加工，采集方法，加工过程，检定标准与美国原产优等胎牛血清*一致，市场*美国原产的。经过3次100nm过滤，内毒素含量≤25EU/ml，血红蛋白含量≤25mg/dl
2、Hyclone的南美优级胎牛血清
大体与加拿大的优等血清是一样的，级别也非常相似，货号是sv30087.02，该胎牛血清来源于南美洲，以封闭的心脏穿刺方式采集，产品经3次100nm 过滤，经严格检测确保无支原体，细菌病毒检测依据美国药典(USP)和美国联邦法规第九篇(9CFR)，内毒素含量≤10 EU/ml，血红蛋白含量≤20 mg/dl，*符合美国 HyClone? 优等胎牛血清的检测标准。
3、Gibco的澳大利亚胎牛血清
情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多，市场价也是3200元/500ml左右。
这一级别的血清，也能用于干细胞培养，可是，不象特级胎牛血清那么。
因为，此胎牛血清属于澳大利亚生产的，不在疫区，可以正常报关进口，目前没有受到任何影响，所以，就目前而言，算是的胎牛血清了，有不少客户都此血清来培养干细胞，效果还是比较不错。
4、TCB的优级胎牛血清
情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多，市场价也是2300元/500ml左右。
这一级别的血清，也能用于干细胞培养，可是，不象特级胎牛血清那么。
第三类，一般级别的进口胎牛血清
1、Hyclone的南美胎牛血清
目前，市场上用的zui多的Hyclone血清是南美胎牛血清(FBS)SV30087 ，此血清采自南美，在国内(兰州)过滤并测试检验，经三次100纳米过滤，根据中国商标法的规定标贴中文标签，内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤20mg/d。
此血清广泛用于各种肿瘤细胞的培养，还没有资料记载能够用于干细胞，也听说有少数人用于干细胞培养的，不过，因为本身血红素比较高，所以，不要用于干细胞，
2、Gibco的南美胎牛血清
这款血清，是Gibco针对Hyclone南美胎牛血清做的，价格比较贵，好像是1780元/500m。
3、Gemini的胎牛血清
4、TCB的胎牛血清
5、PAA的胎牛血清
6、JRH澳洲胎牛血清
第四类，国产的各种系列胎牛血清
国产的胎牛血清，国内没有严格意义的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而国内都是剖腹产出胎牛，8小时左右取血，然后，进行过滤分装。

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血清淀粉样蛋白A(SAA)

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