鱼肿瘤坏死因子a(TNF-a)ELISA试剂盒实验使用说明书

　　鱼肿瘤坏死因子a(TNF-a)ELISA检测试剂盒使用说明书

　　BS-3794鱼肿瘤坏死因子a(TNF-a)ELISA试剂盒

　　一、实验原理

　　本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测鱼血清、血浆或组织匀浆中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。实验通过以下步骤实现：

　　将纯化的鱼TNF-α抗体包被于微孔板形成固相抗体

　　加入样本后，样本中的TNF-α与固相抗体结合

　　加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，形成"抗体-抗原-酶标抗体"复合物

　　经洗涤后加入底物TMB显色

　　显色深浅与样本中TNF-α浓度呈正相关，通过酶标仪测定吸光度计算含量

　　二、试剂盒组成

　　96孔/48孔酶标板(预包被抗体)

　　标准品(冻干粉，需复溶)

　　标准品稀释液

　　样本稀释液

　　HRP标记检测抗体

　　显色底物A液(TMB)

　　显色底物B液

　　终止液

　　浓缩洗涤液(20-30倍浓缩)

　　封板膜

　　说明书

　　三、自备器材

　　酶标仪(450nm波长)

　　精密移液器及枪头(0.5-10μL、2-20μL、20-200μL、200-1000μL)

　　37℃恒温箱

　　洗板机(或手动洗板装置)

　　去离子水

　　离心机(2000-3000rpm)

　　四、样本处理

　　血清样本

　　室温血液自然凝固10-20分钟

　　2000-3000rpm离心20分钟

　　立即分离血清，避免溶血

　　分装保存：-20℃(避免反复冻融)

　　血浆样本

　　使用EDTA/肝素抗凝

　　3000rpm离心30分钟

　　立即分离血浆

　　分装保存：-20℃(避免反复冻融)

　　组织匀浆

　　组织块加入生理盐水捣碎

　　3000rpm离心10分钟

　　取上清液检测

　　五、操作步骤

　　试剂准备‌：

　　标准品：冻干粉加1mL标准品稀释液复溶，静置10分钟后混匀，按说明书进行倍比稀释

　　洗涤液：浓缩液用去离子水稀释(20-30倍)，室温使用

　　加样‌：

　　设空白孔、标准孔、样本孔

　　每孔加100μL标准品/样本

　　37℃孵育90分钟

　　洗板‌：

　　甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液

　　静置1分钟后甩去，重复5次

　　吸水纸上拍干

　　加酶标抗体‌：

　　每孔加100μL HRP标记抗体(空白孔除外)

　　37℃孵育60分钟

　　显色‌：

　　每孔加底物A、B各50μL

　　37℃避光孵育15分钟

　　终止反应‌：

　　每孔加终止液50μL

　　15分钟内测定OD值

　　六、注意事项

　　试剂保存‌：

　　2-8℃保存，有效期6个月

　　使用前室温平衡20分钟

　　浓缩洗涤液结晶时，37℃水浴溶解

　　操作规范‌：

　　不同浓度标准品/样本使用新枪头

　　加样顺序保持一致保证孵育时间相同

　　显色底物避光保存，变蓝即失效

　　终止液加入顺序与底物一致

　　质量控制‌：

　　标准曲线R值应≥0.95

　　批内CV<10%，批间CV<15%

　　灵敏度通常<1.0ng/mL

　　七、结果计算

　　以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线

　　样本OD值代入标准曲线计算浓度

　　样本稀释倍数需在最终结果中乘以相应系数

　　八、性能指标

　　检测范围：3-80ng/mL(具体以实际试剂盒为准)

　　特异性：不与其他细胞因子交叉反应

　　重复性：板内/板间变异系数符合要求

　　九、安全提示

　　终止液含溶液，操作时注意防护

　　所有废弃物按生物危害物处理

　　实验过程避免交叉污染

　　注：以上仅供参考，本产品仅供科研使用，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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