反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:
①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基,特别是末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
产品名称 | 牛病毒性腹泻病毒型PCR检测试剂盒供应商 |
英文名称 | Bovine Viral Diarrhea Virus 2 (BVDV2)2RTPCR |
分类 | PCR检测试剂盒 |
特点:
高特异性:与其他病毒无交叉反应,无非特异性扩增;
高灵敏度:检测灵敏度可达10~100;
操作简便:该系列所有试剂均采用相同的体系和条件,可同时进行多个检测;
高通量:多种双重PCR检测以及三重PCR检测试剂盒。
样品 DNA 的制备:
1.用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DNA 片段作为阳性对照。
2.标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头,在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中,得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
使用及效果:
PCR反应特点
(1) 特异性强
PCR反应的特异性决定因素为:
①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基配对原则;
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
(2) 灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中zui小检出率为3个细菌。
(3) 简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
(4) 对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活PCR技术概论。
赖氨酸脱羧酶肉汤358-23071 20支2-溴-3-己基噻吩、2,5-二溴-3-己基噻吩
ELISAKitforHumanRenalase100mg 0.78-50 ng/mL别嘌 ALLOPURINOL(P)
人胆管癌细胞,HuH28细胞25mg1 x 10^6 cells/T25培养瓶多聚-L-赖氨酸
CD166/ALCAM抗體(APC),鼠單抗5mgFCM 去甲基蟛蜞内酯 DEMETHYLWEDELOLACTONE(RG)(PLEASE CALL)
西尼罗河病毒(WNV)核酸检测试剂盒(RT-PCR法)952068-64-3 20mgParishin D HPLC≥98% 78-5000 pg/mL巴利森苷D
Ppp1r8抗體,兔多抗,抗原親和純化 128-39-2 100mg 0.999WB IP 2,6-二叔丁基苯
小鼠骨髓充质干细胞,MMSC细胞 20mg HPLC≥98%Kaempferol用于含量测定5 x 10^5 cells/T25培养瓶山;山柰;3,4',5,7-四羟基黄
Lipopolysaccharidebinding蛋白/LBP抗體,兔多抗,抗原親和純化4168-17-6HPLC≥98%A067120mg/支ELISA 石酸长春质碱
人成纤维细胞生长因子10(FGF-10)ELISA试剂盒590-46-5 20mg Betaine hydrochloride 0.312-20 ng/mL盐酸甜菜碱
PNLIPRP1/PLRP1抗體,兔多抗,抗原親和純化483-15-8C20H19NO4Dihydroberberine≥98%ELISA IHC-P 二氢小檗碱
ELISAKitforHumanImportinsubunitalpha-25G 0.312-20 ng/mL1,4-双[2-(4-甲基-5-苯基噁唑基)]苯 [用于闪烁光谱法] 1,4-Bis[2-(4-methyl-5-phenyloxazolyl)]benzene [for scintillation spectrometry]>98.0%(LC&N)
马铃薯葡萄糖琼脂(含氯霉素)5KG 250PEG8000 聚乙二
人线粒体CDP-甘油二酯-甘油-3-磷酸3磷酯酰转移酶(PGPsynthase1)ELISA试剂盒10mg 0.312-20 ng/mLDIOSMETINIDINE CHLORIDE(SH)
绵羊肺成纤维细胞,OAR-L1细胞50g1 x 10^6 cells/T25培养瓶L-半胱氨酸
ELISAKitforHumanE-selectin5mg 0.156-10 ng/mL黄芩素 BAICALEIN(P)
大鼠小肠粘膜上皮细胞 20mg HPLC≥98%Hecogenin用于含量测定5 x 10^5 cells/T25培养瓶海柯皂苷元;番麻皂素,辛酸己酯;海柯吉宁
牛病毒性腹泻病毒型PCR检测试剂盒供应商紫锥菊标准品试剂盒 ECHINACEA COMPLETE STANDARDS KIT(P) (AHP Verified) 5 x 10mg Chordin抗體,兔多抗,抗原親和純化
山栀苷甲酯 HPLC≥98% shanzhiside methylester 小鼠股动脉平滑肌细胞 用于含量测定
对羟基苯乙 C8H8O2 4'-Hydroxyacetophenone APLP1/Amyloid-like蛋白1抗體,兔多抗,抗原親和純化 ≥98%
辛可宁 CINCHONINE(SH) 5g IL33/Interleukin-33/NF-HEV抗體,鼠單抗
染料木素 C15H10O5 Genistein PROS1/蛋白S抗體,兔多抗,抗原親和純化 ≥98%
人参皂苷Rb1;人参皂甙Rb1 20mg Ginsenoside Rb1 ELISAKitforHumanSerumalbumin HPLC≥98%
里卡灵A 5mg Licarin A 人E3泛素蛋白连接酶HACE1(E3ubiquitin-proteinligaseHACE1)ELISA试剂盒
胆固 CHOLESTEROL(SG) 1g ELISAKitforHumanADP/ATPtranslocase3