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货号 | 产品名称 | 规格 |
AS6321143 | 丙酮酸脱氢酶（PDH)测试盒（比色法） | 100管/96样 |
AS6321143 | 丙酮酸脱氢酶（PDH)测试盒（比色法） | 50管/48样 |
测定意义
PDH（EC 1.2.4.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。
测定原理
PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致600nm光吸收的减少。
需自备的仪器和用品
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一：100mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：20mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：1.5mL×1支，-20℃保存；
试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；
样本的前处理
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
将匀浆600g，4℃离心5min。
弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PDH（此步可选做）。
在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体PDH活性测定。
测定步骤
分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。
样本测定
（1）在试剂五中加入19mL试剂四充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL试剂五，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
PDH活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=192×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.385×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=384×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.77×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
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