苦丁茶中总黄酮的三波长-光谱法定量分析

摘要：采用三波长-分光光度法测定苦丁茶中有效化学成分黄酮的含量，有效地消除了吸收峰不对称给定量分析能造成的影响，并校正了基于干扰组分（饮料中添加剂等）的吸收光谱具有可能是散射造成的背景线性吸收产生的基线倾斜。回归方程为：ΔA=-3.702×0.001+3.7023C，相关系数r=0.9994，黄酮的浓度在600—1600mg／L范围内，分别在波长为λ1=470nm，λ2=420nm，λ3=370nm处测吸光度时，则△A与浓度C之间呈良好的线性关系，可按标准曲线法进行定量分析。方法的回收率为98％一112％，相对标准偏差小于1.14％。方法的准确度与精密度均令人满意，而且操作简便易行。
关键词：总黄酮，苦丁茶，三波长-分光光度法
1 引 言
苦丁茶是植物冬青科冬青属苦丁茶（L／ex Kudincha C．J．Tseng）的叶。苦丁茶，又称“生态茶”，含有多种生物活性成分、l8种氨基酸和各种微量元素，具有提神醒脑，清热解毒，清肝明目、降脂、降压、解烟、解酒等功效，药用价值较高，因而引起人们广泛注意。有关苦丁茶在生药学及其药理作用等方面的研究报道较多，对于黄酮类化合物的相互分离以及单一黄酮成分的定量分析，常用的方法有荧光光度法、液相色谱法。而对于评价和监测含黄酮类天然产物的总黄酮含量的测定往往采用分光光度法。一般常用的分光光度法存在一定缺陷，如果加入铝盐会使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的络合物，而且吸收带I会明显产生红移，吸光度也大大增加。但由于干扰成分使吸收峰不对称给定量分析造成一定的影响。本实验采用三波长-分光光度法 测定苦丁茶中黄酮的含量，有效地消除了吸收峰不对称给定量分析造成的影响，并校正了基于干扰组分（饮料中添加剂等）的吸收光谱具有可能是散射造成的背景（散射与波长有关，在短波处散射较强）线性吸收产生的基线倾斜。
在黄酮类化合物的紫外光谱吸收中，主要吸收带是由300～400nm之间的吸收带I和240～280nm之间的吸收带Ⅱ组成。因为苦丁茶中含有氨基酸、维生素和生物碱等化合物，在带I和带Ⅱ范围内均有一定程度的吸收，会对黄酮的测定产生干扰。加入铝盐使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的络合物，其反应过程。
则吸收带I会明显产生红移，同时吸光度也大大增加。因此，选择铝络合物显色体系来测定苦丁茶中总黄酮的含量。但由于吸收峰不对称给定量分析造成一定的影响。采用三波长-分光光度法测定苦丁茶中黄酮的含量，有效地消除了吸收峰不对称给定量分析造成的影响，并校正了基于干扰组分的吸收光谱具有线性吸收产生的基线倾斜，提高了定量分析的准确度。本实验选用430、353和284nm处测量吸光度，黄酮浓度在600～1600mg／L范围内，△A与浓度C呈良好的线性关系。
2 实验部分
2．1 仪器与实验材料
TU-1201紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪RE52CS型（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温水浴锅HHS21-4型（上海医疗器械五厂）；旋片式真空泵2XZ-4型（临海市精工真空设备厂）；中华牌加热器ZHQ型（巩义市英峪仪器一厂）；电子节能控温仪DKW一Ⅲ型（巩义英峪仪器一厂）。
黄酮标准品：由辽宁生物技术科学股份有限公司提供。1％的AlCl3溶液：称取AlCl3·6H20 1.7567g，加水溶解并稀释至100mL。黄酮标准储备液：称取0.2 g黄酮标准品（准确至0.0001 g），置于100mL的容量瓶中，加水使其溶解稀释至刻度，摇匀备用；所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
苦丁茶：海南产苦丁茶和桂林产苦丁茶。
2．2 吸收曲线的绘制及三波长的确定
准确吸取黄酮标准储备液1mL，注入10mL容量瓶中，加1％的AlCl3，溶液，充分混合至刻度，用1cm的比色皿在波长200～600nm范围内扫描，绘制出其吸收曲线，用作图法确定出3个测定波长分别为λl=430nm、λ2=353nm和λ3=284nm。
3 结果与讨论
3．1 标准曲线的绘制
分别取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0mL的黄酮标准储备液，注入10mL容量瓶中，加1％的AlCl3溶液，充分混合至刻度，在其波长为λ1=430 nm、λ2=353 nm和λ3=284nm分别测定其吸光度值。
3．2 稳定性实验
用与绘制吸收曲线配制相同的方法配制的样品进行稳定性实验，结果表明：样品放置1h上，测得其吸光度值不变。
3．3 回收率及方法精密度
根据前面确定的测试条件，按上述实验方法制备6个不同浓度的样品，按标准加入标准物，在测定波长下测定△A，求得其平均回收率、标准偏差及相对标准偏差。本法的回收率为98.0％一112.0％，相对标准偏差小于1.14％，方法的准确度与精密度均较高。由于ΔA值与黄酮的浓度C成正比，在所选择的三个波长处，其相应的吸收光谱曲线上三点在一条直线上，有效地消除本底漂移及吸收峰不对称给定量分析造成的影响，因此三波长．分光光度法为测定苦丁茶中黄酮的含量提供了更准确更可行的方法。
3．4 样品分析
取待测苦丁茶样品，按上述实验方法制备样品溶液，按操作条件，在测定波长处测其吸光度，分析结果列于表。黄酮含量的多少是衡量苦丁茶品位优劣的标志，实验结果表明海南苦丁茶优于桂林苦丁茶。
References
1 Zhao Huichun（赵慧春），Feng Ruiqin（冯瑞琴），Fang Xin（方昕）．（分析测试学报），1997，16（2）：36～39